一、免疫PCR要點(diǎn)
　　
　?。?）連接分子
　　
　　免疫PCR需要適當(dāng)?shù)倪B接分子連接報(bào)告分子和抗原抗體復(fù)合物。1992年Sano用重組的鏈親和素-蛋白A嵌合體作為連接分子，創(chuàng)立了免疫PCR技術(shù)。該融合蛋白的蛋白A可結(jié)合抗體的Fc段，鏈親和素可結(jié)合DNA分子上的生物素，Sano利用此連接分子把一段生物素化的DNA（PUC19質(zhì)粒DNA）連接到固定在酶標(biāo)板上的抗原抗體復(fù)合物上，成功的檢測(cè)到了牛血清蛋白，比傳統(tǒng)ELISA法的敏感生105倍。
　　
　　1993年，Ruzicha用生物素化單抗-親和素-生物素化DNA分子復(fù)合體代替鏈親和素-蛋白A嵌合體連接的單抗DNA復(fù)合體。Zhou等人發(fā)現(xiàn)鏈親和素（streptavidin）不含糖基，做連接分子特異性優(yōu)于親和素（avidin）；Marian進(jìn)一步指出中性鏈親和素（neutravidin）特異性比鏈親和素更佳，因?yàn)榍罢呤且环N經(jīng)過(guò)特殊修飾了的親和素，大大降低了非特異性吸附的可能。此后鏈親和素（親和素）系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，二者作為免疫PCR的連接分子各有優(yōu)缺點(diǎn)。鏈親和素-蛋白A嵌合體均一穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好，并且此嵌合蛋白可以利用工程菌大量生產(chǎn)，價(jià)格低廉。但目前尚無(wú)商品化的產(chǎn)品可以利用，且蛋白A可以結(jié)合非特異性吸附的抗體或用于捕獲抗原的抗體的Fc段，使之不能用于夾心法。預(yù)先把特異性抗體和該連接分子制成復(fù)合物可解決上述問(wèn)題，用抗體的Fab或F（ab′）2段代替捕獲抗原的一抗也可克服以上困難。
　　
　　生物素、鏈親和素系統(tǒng)有商品化的生物素標(biāo)記的二抗和游離鏈親和素可以利用，因而被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛采用。但親和素為四價(jià)化合物，在制備親和素-生物素化DNA復(fù)合體（avidin-biotinylated-DNAcomplexABDcomplex）時(shí)會(huì)出現(xiàn)3種情況5種分子，即游離親和素、部分飽和親和素（結(jié)合1-3個(gè)生物素分子）、飽和親和素。只有部分飽和親和素對(duì)檢測(cè)有用，其他兩種情況不但對(duì)檢測(cè)無(wú)用而且占用檢測(cè)位點(diǎn)，降低免疫PCR的敏感性。有的學(xué)者采用分別加入生物素化二抗、游離親和素生物素化DNA分子的方法克服了以上缺點(diǎn)，但延長(zhǎng)了檢測(cè)周期，使檢測(cè)步驟繁鎖，增加了系統(tǒng)誤差。有人用2-亞氨基生物素做配基的瓊脂糖珠親和層析法制備ABD復(fù)合物，克服了以上不足。
　　
　　（2）報(bào)告分子
　　
　　理論上任何一段序列已知、可有效擴(kuò)增的DNA都可作為免疫PCR的報(bào)告分子，但考慮到DNA序列的同源性和用于PCR擴(kuò)增的效率問(wèn)題，該報(bào)告分子和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)必須保證有良好的擴(kuò)增效果，有近似理論的擴(kuò)增率，該報(bào)告分子與反應(yīng)體系中可能存在DNA分子不應(yīng)有同源性，以避免因DNA污染，而出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。繼Sano用PUC19質(zhì)粒后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后用PINM30、λ噬菌體、舌蘭病毒等作為報(bào)告分子，取得了良好的效果。鄭永晨研究發(fā)現(xiàn)線性化的腺病毒六鄰體（AdAt）基因重組質(zhì)粒非常適于做免疫PCR的報(bào)告分子。目前免疫PCR的報(bào)告分子多數(shù)是用DNA聚合酶將生物素化的堿基聚合到DNA末端，理論上一條DNA鏈上只標(biāo)記一個(gè)生物素分子才具有zui高的敏感性。AdAt質(zhì)粒易于制備和純化，分子較單一，不易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，經(jīng)HindⅢ酶切后粘性末端上只有加一個(gè)生物素分子，保證了免疫PCR的zui高敏感性。質(zhì)粒pHNL10含有編碼木薯羥基腈裂解酶的基因，該基因片段是從木薯cDNA文庫(kù)中經(jīng)PCR擴(kuò)增所得，植物DNA與檢測(cè)系統(tǒng)中可能存在的任何DNA都不同源，用它做免疫PCR的報(bào)告分子，可避免因DNA污染而造成的非特異性擴(kuò)增。
　　
　?。?）免疫PCR的載體
　　
　　由于適合抗原抗體反應(yīng)的酶標(biāo)板不能插入普通PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，Sano先在酶標(biāo)板上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)和報(bào)告分子的連接反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)熱變性，把酶標(biāo)板上的報(bào)告分子轉(zhuǎn)移到普通PCR管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。此法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，但步驟繁鎖，容易在轉(zhuǎn)移過(guò)程中丟失樣品，系統(tǒng)誤差大，結(jié)果不穩(wěn)定。國(guó)外有人用特殊的96孔中V形板做載體，所有步驟均在同一板上進(jìn)行，zui后插入特殊的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。此法克服了上述缺點(diǎn)，但需特殊的PCR儀，價(jià)格昂貴，目前尚不能在國(guó)內(nèi)推廣普及。用于PCR反應(yīng)的eppendof管多用聚氯乙烯，在材料上有別于酶標(biāo)反應(yīng)板，不適合包被抗原（抗體）。徐平西等人用戊二醛做包被劑將抗原（抗體）率地包被于普通PCR管，使免疫PCR能利用普通PCR儀在同一管中連貫進(jìn)行。
　　
　　（4）免疫PCR的顯示系統(tǒng)
　　
　　zui基本的顯示方法是凝膠電泳法。PCR產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠電泳后，EB染色，紫外線燈下觀察或照像，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶為陽(yáng)性。也有人將電泳后的PCR產(chǎn)物印記在硝酸纖維素膜上進(jìn)行核酸雜交，以雜交信號(hào)顯示檢測(cè)結(jié)果。另外也可不用電泳，在PCR擴(kuò)增時(shí)用放射性同位素、熒光素、生物素、酶等標(biāo)記引物，使PCR產(chǎn)物帶有一定標(biāo)記，然后通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡、酶底物顯色等顯示檢測(cè)結(jié)果。凝膠電泳法既適合單抗原的檢測(cè)，又適合多抗原的檢測(cè)，且能區(qū)分PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增帶和非特異性擴(kuò)增帶，除了EB染液對(duì)人體有害需防護(hù)外，對(duì)環(huán)境基本無(wú)污染，因而被廣泛應(yīng)用。其他方法一般只適合于單抗原檢測(cè)，對(duì)引物要求較高，且無(wú)法區(qū)分非特異性擴(kuò)增帶，因此應(yīng)用較少。
　　
　?。?）假陽(yáng)性的控制
　　
　　充分洗滌是必要的，有的學(xué)者總共用了50多次洗滌，zui大限度地消除了非特異性吸附，但同時(shí)也增加了檢測(cè)步驟，延長(zhǎng)了檢測(cè)周期。充分封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)也至關(guān)重要，常用的封閉劑有牛血清蛋白（BSA）、脫脂奶粉、鮭魚精DNA，Chang在PBS中加入2%的BSA取得了良好的效果。適當(dāng)降低報(bào)告分子的濃度，采用不等量引物（適當(dāng)減少其中一種引物的濃度）均可減少非特異性擴(kuò)增，提高特異性。另外應(yīng)設(shè)立假陽(yáng)性指示分子和陰性對(duì)照。
　　
　　免疫PCR優(yōu)化策略及改進(jìn)
　　
　　（1）免疫PCR的優(yōu)化策略--新型連接分子的出現(xiàn)
　　
　　1）葉綠素分子和鏈酶卵白素
　　
　　喬生軍等用自然界普遍存在的葉綠素分子（chlorophy）作為共價(jià)連接蛋白與核酸的中間分子，構(gòu)建了甲胎蛋白（AFP）抗體的基因探針，此探針人為地把抗體直接錨定在雙鏈DNA分子上，復(fù)合分子性質(zhì)均一穩(wěn)定，室溫至少保存6個(gè)月，大大簡(jiǎn)化了中間步驟，降低了成本，使免疫PCR更易推廣。也有人用鏈酶卵白素將生物素化的抗體與生物素化的DNA分子直接連接，也得了良好的較果。
　　
　　2）雙特異融合蛋白
　　
　　任軍將編碼單鏈抗體和鏈親和素融合蛋白的基因插入載體在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得了具備結(jié)合生物素和抗原分子的雙特異性融合蛋白，可直接連接抗體和生物素化的DNA分子。該融合蛋白可利用工程菌大量制備，性質(zhì)優(yōu)良，價(jià)格低廉。