免疫沉淀是基于傳統(tǒng)親和純化方法開發(fā)的,在含有目的抗原的細胞裂解液中加入特定的抗體以及ProteinA-Beads(預先將ProteinA固定結合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、ProteinA與抗體的FC的特異性,形成“抗原-抗體-ProteinA-Beads”復合物,清洗離心后去除溶液中未結合的雜蛋白,終檢測是否存在目的蛋白。與傳統(tǒng)的柱式親和純化相比,其目標是僅分離足夠用于WesternBlot或其他檢測方法檢測的蛋白質。通??梢詫⒁烟幚砗臀刺幚淼臉悠愤M行比較,從而評估目標蛋白的相對量。
在實驗中,用于檢測的抗體可以是預固定的,或者是游離的。通常,預固定抗體法更適用于IP,但是,當目標蛋白濃度較低、抗體與抗原的結合親和力較弱的情況下,可以使用游離的抗體形成免疫復合物,效果會比較好。
簡單的免疫沉淀可用于分離單個蛋白(抗體的靶抗原)以研究其特性、結果、表達、活化或修飾狀態(tài)。IP也用于研究初級抗體/蛋白與其他蛋白或核酸的相互作用。
主要類型:
1、免疫共沉淀(Co-IP)
免疫共沉淀是研究蛋白質相互作用的常見技術,基本原理與IP相同。利用抗體共沉淀裂解物中與抗原結合的抗體或相關蛋白復合物。
2、染色質免疫沉淀(ChIP)
可用于鑒定基因組中與DNA結合蛋白(如轉錄因子和組蛋白)結合的區(qū)域。將蛋白質與DNA暫時交聯(lián)固定并剪切DNA,目標蛋白與核酸序列一起被沉淀后進行DNA鑒定。
3、RNA免疫沉淀(RIP)
原理與ChIP相似,利用RNA結合蛋白被沉淀后,用RT-PCR或cDNA測序對沉淀進行RNA鑒定。
4、標簽免疫沉淀
上述方法中均依賴特異性識別靶蛋白的抗體,需要抗體很少或不能與胞內其他靶標發(fā)生交叉反應,存在局限性。但利用表位標記蛋白,就可以使目的蛋白更易識別特定抗體并與之結合產生沉淀。