熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析的方法。它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對(duì)初始模板定量分析的問(wèn)題。具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

　　

　　熒光定量PCR結(jié)果分析：

　　

　　一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化；在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，無(wú)法計(jì)算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便，在熒光定量PCR技術(shù)中引入了幾個(gè)重要的概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CT值。

　　

　　注：

　　

　　橫坐標(biāo)：代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù);

　　

　　縱坐標(biāo)：代表熒光強(qiáng)度，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)收集。

　　

　　(2)熒光閾值(Threshold)

　　

　　在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

　　

　　(3)CT值

　　

　　每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時(shí)，對(duì)于熒光PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，CT值也是判讀樣品陰陽(yáng)性的重要指標(biāo)。