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熒光定量PCR分析常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)說(shuō)明
更新時(shí)間:2019-08-22 點(diǎn)擊次數(shù):3641次
 
  
  實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)指的是在PCR進(jìn)行的同時(shí),對(duì)其過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)的能力(即實(shí)時(shí))。因此,數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,而非PCR結(jié)束之后,進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來(lái)了革命性的變革。在熒光定量PCR(qPCR)中,反應(yīng)以循環(huán)中檢測(cè)到目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間點(diǎn)為特征,而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,則會(huì)越快觀察到熒光的顯著增加。相反,終點(diǎn)法檢測(cè)(也稱“讀板檢測(cè)”)測(cè)量的是PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。
  
  熒光定量PCR將PCR擴(kuò)增和檢測(cè)合并為單一步驟。這樣就無(wú)需使用凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè),更重要的是這一方法是真正定量的。在熒光定量PCR中,熒光染料被用來(lái)在熱循環(huán)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR儀器在反應(yīng)的對(duì)數(shù)期測(cè)定熒光信號(hào)的積累,獲得快速的PCR產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。
  
  熒光定量PCR分析常見(jiàn)術(shù)語(yǔ):
  
  擴(kuò)增子:PCR過(guò)程而產(chǎn)生的DNA短片段
  
  擴(kuò)增曲線:根據(jù)熒光信號(hào)相對(duì)于循環(huán)數(shù)而制作的曲線
  
  基線:PCR起始時(shí),熒光信號(hào)還未發(fā)生變化的幾個(gè)循環(huán)
  
  Ct(閾值循環(huán)):熒光信號(hào)超過(guò)NTC(無(wú)模板對(duì)照樣品)固定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。用于對(duì)擴(kuò)增質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。
  
  核酸目標(biāo):(也稱為“目標(biāo)模板”)——需要擴(kuò)增的DNA或RNA序列
  
  惰性參比染料:一種可作為內(nèi)部對(duì)照,以用于在數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)報(bào)告基團(tuán)染料信號(hào)進(jìn)行均一化的染料。均一化是對(duì)因濃度或體積變化而隨之引起波動(dòng)進(jìn)行的必要校正。所有的SDSPCR試劑盒都提供了參比熒光對(duì)照。
  
  Rn(均一化報(bào)告基團(tuán)):報(bào)告基團(tuán)染料釋放的熒光強(qiáng)度除以惰性參比染料釋放的熒光強(qiáng)度
  
  Rn+:一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分,包括模板
  
  Rn-:未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過(guò)以下方式獲?。?/div>
  
  實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)運(yùn)行的早期循環(huán)(產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)之前的循環(huán)),或不含有任何模板的反應(yīng)。
  
  ΔRn(deltaRn):在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號(hào)量級(jí)。
  
  ΔRn可通過(guò)以下公式計(jì)算:(Rn+)–(Rn-)標(biāo)準(zhǔn)品具有已知濃度的A樣本,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,您可構(gòu)建用于未知樣品定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  
  閾值:早期PCR循環(huán)時(shí)Rn值的平均標(biāo)準(zhǔn)差,乘以相應(yīng)的校正系數(shù)閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)定在PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)的相關(guān)區(qū)域。
  
  未知:具有未知模板量的樣品。即,您需要進(jìn)行檢測(cè)的樣品。
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