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免疫熒光實驗基本步驟說明
更新時間:2019-06-24 點擊次數(shù):1141次
 
  
  免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescencetechnique)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。
  
  免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備(通俗的說法是細(xì)胞爬片)是免疫熒光實驗的步,細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要,原因很簡單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片(SlidesorCoverslips)的處理以及細(xì)胞的活力,有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門,非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?,合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法(如ELISA或WesternBlot)中的相同步驟是類似的,重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體,因此必須謹(jǐn)記避光操作,此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。
  
  基本實驗步驟:
  
 ?。?)細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時,將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞,取對數(shù)生長細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
  
  (2)固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5min。
  
 ?。?)通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min,通透后用PBS洗滌3×5min。
  
 ?。?)封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉,時間一般為30min。
  
 ?。?)一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。
  
  (6)二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h,PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
  
 ?。?)封片及檢測。滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。
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