腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療失敗的重要因素之一,成為目前阻礙腫瘤治療的絆腳石。因此,探索腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因以及如何改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥仍是目前研究的熱點和難點。腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程,它的機(jī)制廣泛牽涉到藥物代謝學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)等多個學(xué)科,這就決定了腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是復(fù)雜的,因此體外建立化療藥物耐藥細(xì)胞株仍然是研究腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的重要方法。
一種藥物長期作用于某類細(xì)胞,殺死其中沒有抗性的細(xì)胞,而對這類細(xì)胞中具有抗性的細(xì)胞不能殺死,即進(jìn)行了選擇。具有抗性的細(xì)胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代,但再用這種藥物時表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細(xì)胞的耐藥性,采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對特定藥物產(chǎn)生耐藥性,從而構(gòu)建出對特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞株。
耐藥細(xì)胞株構(gòu)建實驗:
原理:細(xì)胞與低劑量的藥物長期接觸,引起細(xì)胞本身藥物化學(xué)過程的改變,細(xì)胞膜上出現(xiàn)Pgp糖蛋白,使細(xì)胞逐漸對藥物耐受,隨著藥物濃度的遞增,其耐受程度逐漸加強(qiáng)。
實驗材料及試劑
培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液槍等;血清培養(yǎng)液、PBS、相應(yīng)作用的藥物等。
實驗內(nèi)容
大劑量間隙作用:對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,生長至70%~80%匯合時,將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2遍,更換不含藥物培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞恢復(fù)生長,培養(yǎng)一段時間后更換不含藥物的RPMI-1640(DMEM)胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長、進(jìn)入對數(shù)生長期后,傳代兩次,再將篩選出的細(xì)胞在濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時間,共經(jīng)過1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個作用時間段,約8個月的培養(yǎng),終使得細(xì)胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代,然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細(xì)胞的生物特性及耐藥指標(biāo)。
濃度梯度遞增間隙作用:采用藥物濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導(dǎo),對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞處于60~70%濃度對數(shù)期生長時,加入起始濃度為低濃度的藥物作用24h,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2遍,更換不含藥物培養(yǎng)基,細(xì)胞恢復(fù)生長后,消化傳代復(fù)以低濃度作用細(xì)胞24h,待細(xì)胞增殖至正常形態(tài)后,重復(fù)上述藥物沖擊,每種濃度沖擊8次。待細(xì)胞在此濃度穩(wěn)定生長后,提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng),藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導(dǎo)歷時大約9個月,直到細(xì)胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長。