免疫熒光的實驗主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的步，細胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。
免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關鍵。后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。
由于操作步驟比較多，同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個的免疫熒光實驗結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實驗條件進行反復優(yōu)化外，還必須設立嚴謹?shù)膶嶒瀸φ铡？傊庖邿晒鈱嶒瀼募毎麡悠诽幚?、固定、封閉、抗體孵育到后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質(zhì)量，才能終達到你的實驗目的。
抗原抗體反應，其具有高度的特異性。先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術測定含量。
