免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
　　
　　免疫沉淀的實驗過程比較簡單，一般分為3個階段；①抗原溶液的制備；②裂解物非特異性本底的預(yù)處理；③免疫復(fù)合物的形成與純化。免疫沉淀的步是制備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉淀的材料來源，但免疫沉淀一般采用細(xì)胞或組織制備的裂解物。裂解物的制備可采用多種方法，其中選用溫和的去污劑如非離子去污劑來裂解細(xì)胞。該方法能溶解細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)之間許多微弱的相互作用，釋放出大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)抗原。更重要的是方法十分溫和，不破壞大多數(shù)抗原的結(jié)構(gòu)和酶的活力。如果對抗原結(jié)構(gòu)的完整或活力要求不嚴(yán)，或者抗原結(jié)合較為緊密，可以采用比較劇烈的條件來制備裂解物，如在強(qiáng)變性劑的溶液中進(jìn)行煮沸，然后在免疫沉淀前經(jīng)過稀釋去除變性劑。一旦細(xì)胞裂解液制備好，即可進(jìn)行預(yù)處理。
　　
　　免疫沉淀常見問題：
　　
　　1.免疫沉淀實驗應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？
　　
　　答：每次沉淀實驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。
　　
　　2.用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實驗？
　　
　　答：抗體的性質(zhì)對免疫沉淀實驗影響很大。抗體不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。一般來說，多抗是沉淀反應(yīng)的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。
　　
　　3.免疫沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？
　　
　　答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC（sodiumde-oxycholate），SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實驗者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體*失去活性。
　　
　　4.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？
　　
　　答：從活性細(xì)胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實驗。
　　
　　5.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？
　　
　　答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。