實(shí)時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。
　　
　　檢測指標(biāo)是：各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
　　
　　實(shí)時熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
　　
　　實(shí)時熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
　　
　　實(shí)時熒光定量PCR的廣泛應(yīng)用：
　　
　　•可以對各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測。過去zui常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是cDNA芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時PCR技術(shù)和高通道實(shí)時PCR儀的出現(xiàn)，無疑為這種檢測提供了極大的方便。
　　
　　•可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號明顯強(qiáng)于另一種熒光信號，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（MolecularBeacon）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計的探針。
　　
　　•可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測將會變得簡單而準(zhǔn)確。
　　
　　•可以進(jìn)行DNA甲基化檢測，DNA甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
　　
　　•對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床PCR試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。
　　
　　•閃晶生物同時提供藥物伴隨診斷(companiondiagnostic)方法如EGFR、BRAFV600E突變、HER2擴(kuò)增、BCR-Abl、PML-RAR、ALK融合基因等。